Open Access

Survival and Virulence of Campylobacter spp. in the Environment (2012)

Abstract

Campylobacter er den hyppigste årsag til fødevarebåren sygdom i Europa, og dette vigtige zoonotiske patogen har med god grund været i fokus i mange forskningsprojekter i de seneste år. Vores viden om denne bakteries biologi og patogenitet er stadig meget begrænset i forhold til mange andre, mindre hyppigt forekommende, sygdomsfremkaldende bakterier. Formålet med dette PhD projekt har været at undersøge overlevelse og virulens af Campylobacter spp. i forskellige medier, så som hønse- og svine gødning, og i relation til protozoer. I det første delprojekt, hvor vi anvendte både dyrkningsbaserede og molekylære påvisningsmetoder (RT-qPCR), fandt vi at levende Campylobacter celler kunne påvises i gødningsprøver i op til 5 dage, uafhængigt af om prøven naturligt indeholdt Campylobacter eller om de var tilsat til en negativ prøve. Dyrknings negative prøver var også negative med RT-qPCR, hvorimod vi med DNA baserede assays kunne påvise Campylobacter efter op til 20 dages lagring. I det andet delprojekt undersøgte vi overlevelsen af Campylobacter coli i svine gylle i 30 dage med tre forskellige metoder: Dyrkning, DNA qPCR, og RT-qPCR. Jeg fandt her, at C.coli kan overleve i svinegylle i op til 24 dage ved 4°C. Ved højere temperaturer faldt overlevelsen til 7 dage ved 15°C, og 6 dage 22°C. Overlevelsen ved 42°C and 52°C var meget kort, kun få timer. Jeg fandt i dette delprojekt, at RT-qPCR metoden både kan bruges til at skelne levende fra døde bakterier, og til at studere bakteriens overlevelse og dens potentiale for at fremkalde sygdom, målt på ekspressionen af forskellige virulens gener. I et samarbejde med en anden forsker gruppe, har jeg, med anvendelse af en laboratoriemodel, undersøgt udvaskning til grundvandet. I forsøget anvendtes bakteriofag 28B (Salmonella Typhimurium) og to bakterier: Escherichia coli og Enterococcus spp, som var suspenderet i forskellige fraktioner: rå gylle, og i den flydende fraktion af separeret gylle før og efter ozonbehandling. I den separerede gylle øgedes omfordelingen af mål organismerne i den flydende fraktion i jorden, i forhold til rå gylle, og genfindelsen af E. coli og Enterococcus spp. var højere i den flydende fraktion, selv efter fire udvaskninger af jordsøjlen. Med den flydende fraktion fandtes også en højere udvaskning af E. coli og bakteriofag 28B end med rå gylle, medens ozonbehandling udelukkende reducerede E. coli udvaskningen. Protozoer og amøber er påvist i mange slagtekyllinge huse. Det er blevet vist at fritlevende protozoer kan indeholde og beskytte bakterier, selvom de har passeret igennem en tarmkanal, og efterfølgende kan man påvise levende bakterier inde i dem. Det er derfor meget relevant at studere deres rolle for overlevelsen af Campylobacter. I den anden del af mit PhD projekt har jeg undersøgt mekanismer, der er involveret i interaktionen mellem C. jejuni og de to protozoer Acanthamoeba castellanii og Cercomonas spp., som ofte forekommer i jord og vand. Jeg fandt at C. jejuni kun overlever intracellulært i A. castellanii i en kortere periode (5 timer efter gentamicin behandling) ved 25 ºC og under aerobe forhold. Men til gengæld observerede jeg at A. castellanii virkede fremmende på ekstracellulære vækst af C. jejuni når de blev dyrket i co-kultur ved 37 °C under aerobe betingelser. Denne vækst-fremmende effekt var uafhængig af amøbe – bakterie kontakt, og jeg observerede, at en af A.castellanii’s vigtigste bidrag til at fremme væksten bestod i at fjerne opløst ilt i mediet. For at teste om andre protozoer har virkning på overlevelsen af fødevarebårne patogener så som C. jejuni, S. Typhimurium og Listeria monocytogenes, har jeg undersøgt samspillet mellem dem og jord flagellater, Cercomonas ssp. Når flagellaten dyrkedes sammen med C. jejuni og S. Typhimurium observeredes en god vækst i løbet af 15 dage, mens antallet af flagellater faldt når den blev dyrket sammen med Listeria monocytogenes. Jeg observerede ligeledes at C. jejuni og S. Typhimurium også overlevede bedre, når de blev dyrket sammen med flagellaten, end når de blev dyrket alene. Resultaterne af dette tyder på, at Cercomonas spp., og måske andre jord flagellater kan spille en rolle for overlevelsen af disse bakterier på planters overflade og i jord. Set i lyset af det seneste års udbrud af fødevarebårne sygdomme, vil det derfor være meget interessant at foretage yderligere undersøgelser af disse flagellaters samspil med bakterielle patogener på overfalden af planter, f.eks. grøntsager. I forbindelse med C. jejuni’s optagelse og overlevelse i protozoen, udsættes den for forskellige former for stress, men vores viden om hvordan bakterien overlever og interagerer med protozoen, er meget sparsom. For at undersøge dette har jeg målt på ekspression af C. jejuni tre virulensgener (ciaB, dnaJ, og htrA) under de miljømæssige stressfaktorer: varme, sult, osmose, og oxidation, efter optagelse i protozoen. Jeg undersøgte også de mekanismer, der er involveret i fagocytose og intracellulært drab af C. jejuni i A. castellanii. Varme og osmotisk stress reducerede overlevelsen af C. jejuni betydeligt, mens oxidativ stress ikke havde nogen effekt. Resultaterne af RT-qPCR forsøg viste, at transskriptionen af virulensgenerne i C. jejuni blev svagt opreguleret under varme og oxidative belastninger, men nedreguleres under sult og osmotisk stress; htrA-genet viste den største ned-regulering under osmotisk stress. Resultaterne viste også, at C. jejuni hurtigt taber levedygtighed i løbet af dets intra-amøbe stadie, og at udsættelsen af C. jejuni for miljøbelastninger, ikke fremmer dens intracellulære overlevelse i A. castellanii. Vi fandt desuden at C. jejuni tilsyneladende anvender en særskilt strategi under fagocytosen, der omfatter aktivering af aktin filamenter i fravær af et PI3-kinase-medierede signal. Undersøgelserne viste også at phagolysosomets modning ikke er den primære faktor for drab af C. jejuni i amøben. Sammen tyder disse resultater på, at stressresponset i C. jejuni og dets interaktion med A. castellanii er komplekst og multifaktorielt. ; Campylobacter is the most common cause of food-borne illness in Europe, and this important zoonotic pathogen has been the focus of many research projects and scientific publications in recent years. However, we know less about the biology and pathogenicity of this pathogen than we know about many less prevalent pathogens. In this PhD project, I have investigated the survival and virulence of Campylobacter spp. in various matrices such as chicken faeces, swine manure and in co-culture with protozoa. In the first study, using bacterial culture and RT-qPCR methods, I found that viable C. jejuni cells could be detected for up to 5 days in both spiked and the naturally Campylobacter contaminated chicken faecal samples. Negative RT-qPCR was obtained when viable C. jejuni cells could not be counted by culture. In contrast, using a DNA-based qPCR method, dead or non-viable Campylobacter cells were detected, since all tested samples were positive, even after 20 days of storage. In the second study, the survival of C. coli in swine manure during storage for 30 days was studied by three different methods: bacterial culture (plate counting), DNA qPCR, and RT-qPCR. I found that C. coli could survive in swine manure up to 24 days at 4°C. At higher temperatures, this bacterium survived only 7 days (15°C) or 6 days (22°C) of storage. The survival of C. coli was extremely short (few hours) in samples incubated at 42 and 52°C. I also found that the RT-qPCR method not only can detect and differentiate living bacteria from dead cells, but also can be used to study the survival and potential pathogenicity of bacteria based on expression of different virulence genes. In a collaborated study, I have investigated the leaching potentials of a Salmonella Typhimurium phage type 28B and two bacteria: Escherichia coli and Enterococcus spp., in raw slurry, in the liquid fraction of separated slurry, and in the liquid fraction after ozonation to ground water using intact soil columns models. I observed that solid-liquid separation of slurry increased the redistribution of contaminants in liquid fraction in the soil compared to raw slurry, and the recovery of E. coli and Enterococcus spp. was higher for liquid fraction after the four leaching events. The liquid fraction also resulted in a higher leaching of all contaminants except Enterococcus spp. than raw slurry while the Ozonation reduced E. coli leaching only. Protozoa including amoebae have been found widely in broiler houses. It has been shown that freeliving protozoa may harbor, protect, and disperse bacteria, including those ingested and passed in viable form in feaces. Therefore it is very interesting to study their role in the survival of Campylobacter. In the second part of my PhD project, I have investigated the mechanisms involved in the interactions of Campylobacter and two protozoa: Acanthamoeba castellanii and Cercomonas sp. which are commonly found in soil and water. I have found that C. jejuni can survive intracellularly within A. castellanii for a short time (5 h after gentamicin treatment) at 25ºC in aerobic conditions. Conversely, I found that A. castellanii promoted the extracellular growth of C. jejuni in co-cultures at 37°C in aerobic conditions. This growth-promoting effect did not require amoebae – bacteria contact. Interestingly, I identified the depletion of dissolved oxygen by A. castellanii as the major contributor for the observed amoeba-mediated growth enhancement. To test whether another protozoan rather than Acanthamoeba has similar impacts on survival of C. jejuni as well as other food-borne pathogens S. Typhimurium and Listeria monocytogenesis, I have investigated the interactions between a common soil flagellate, Cercomonas sp., and these three bacterial pathogens. I observed a rapid growth of flagellate in co-culture with C. jejuni and S. Typhimurium over the time course of 15 days. In contrast, the number of Cercomonas sp. cells decreased when grown with or without L. monocytogenes for 9 days of co-culture. Interestingly, I observed that C. jejuni and S. Typhimurium survived better when co-cultured with flagellates than when cultured alone. The results of this study suggest that Cercomonas sp. and perhaps other soil flagellates may play a role for the survival of these food-borne pathogens on plant surfaces and in soil. It would be very interesting to further investigate the impacts of this soil flagellate on the survival of different food-borne pathogens in soil and in plant surface that may explain the epidemiology of recent outbreaks of food-borne diseases from vegetables. During transmission and infection, C. jejuni may encounter many different stresses but little is known about how this bacterium survives and interacts with the protozoa under these conditions. I have investigated the impacts of environmental stress factors, namely heat shock, starvation, osmosis, and oxidation, on the expression of three virulence genes (ciaB, dnaJ, and htrA) of C. jejuni and its uptake by and intracellular survival within A. castellanii. I also investigated the mechanism(s) involved in phagocytosis and killing of C. jejuni by A. castellanii. I observed that heat and osmotic stresses reduced the survival of C. jejuni significantly, whereas oxidative stress had no effect. The results of qRT-PCR experiments showed that the transcription of virulence genes of C. jejuni was slightly up-regulated under heat and oxidative stresses but down-regulated under low nutrient and osmotic stresses, the htrA gene showing the largest down-regulation in response to osmotic stress. The results also showed that C. jejuni rapidly loses viability during its intra-amoeba stage and that exposure of C. jejuni to environmental stresses did not promote its intracellular survival in A. castellanii. In addition, the results indicated that this bacterium uses a distinct strategy for phagocytosis which involves recruiting actin for internalization in the absence of PI 3-kinasemediated signal. The studies also identified that phago-lysosome maturation may not be the primary factor for intra-amoeba killing of C. jejuni. Together these findings suggest that the stress response in C. jejuni and its interaction with A. castellanii are complex and appear multifactorial.

Keywords

Acanthamoeba castellanii, C. coli, S. Typhimurium, Groundwater contamination, Virulence, Environmental stresses, L. monocytogenes, C. jejuni, Flagellate, Cercomonas sp., RT-qPCR, Chicken faeces, Manure separation

Languages

English

Repository

Technical University of Denmark: DTU Orbit / Danmarks Tekniske Universitet

Export