Aportes al conocimiento de los cromosomas holocíneticos de Hemiptera: estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha ; Contributions to the knowledge of the holokinetic chromosomes of Hemiptera: cytogenetic and evolutionary studies in species of Cimicomorpha

Abstract

El presente trabajo de Tesis Doctoral se basa en el estudio citogenético clásico, molecular y evolutivo de especies de insectos hematófagos y predadores pertenecientes a las familias Cimicidae y Reduviidae del infraorden Cimicomorpha (Hemiptera: Heteroptera), que se caracterizan por presentar cromosomas holocinéticos. Se analizó el complemento cromosómico, el desarrollo meiótico masculino, el contenido, distribución y composición de la heterocromatina y el número y la localización de los genes de ADN ribosomal en las siguientes especies: Acanthocrios furnarii 2n=10A+XY/XX (macho/hembra) y Psitticimex uritui 2n=28A+X1X2Y (macho) (Cimicidae: Haematosiphoninae); Brontostoma colossus 2n=28A+XY (macho) y B. discus 2n=34A+X1X2Y (macho) (Reduviidae: Ectrichodiinae); Microtomus lunifer 2n=26A+2m+X1X2Y (macho) (Reduviidae: Hammacerinae); Apiomerus lanipes 2n=22A+XY (macho), Atrachelus (Atrachelus) cinereus 2n=26A+XY/XX (macho/hembra), Cosmoclopius annulosus 2n=24A+X1X2X3Y/X1X1X2X2X3X3 (macho/hembra), Graptocleptes bicolor 2n=22A+XY/XX (macho/hembra) y Zelus obscuridorsis 2n=16A+XY/XX (macho/hembra) (Reduviidae: Harpactorinae); Zelurus femoralis longispinis 2n=20A+XY/X1X2Y (macho) (Reduviidae: Reduviinae); Rhodnius prolixus 2n=20A+XY/XX (macho/hembra) y Triatoma infestans 2n=20A+XY (macho) (Reduviidae: Triatominae). El análisis citogenético clásico realizado en ejemplares de A. furnarii y P. uritui demuestra que la meiosis masculina en ambas especies es aquiasmática y de tipo collochores , la cual podría ser considerada como una característica citogenética que comparten los miembros de la familia Cimicidae. Sin embargo, A. furnarii y P. uritui poseen un patrón propio de meiosis aquiasmática, en el cual se pueden diferenciar tres regiones en los bivalentes autosómicos: i) regiones terminales que se encuentran en repulsión, ii) región media donde los cromosomas se ubican paralelos pero sin contacto y iii) pequeñas regiones dentro de la región media donde se localizan puntos de unión no quiasmáticos o collochores . La población de A. furnarii analizada previamente por otros autores (2n=32A+XY, macho) difiere de la aquí descripta (2n=10A+XY, macho). Esta notable diferencia en el número diploide de autosomas no puede ser explicada como politipismo; por consiguiente, se concluye que estos dos cariotipos pertenecerían a dos entidades taxonómicas diferentes. Sobre la base de los resultados descriptos en la presente Tesis Doctoral y los antecedentes citogenéticos disponibles se sugieren las siguientes tendencias evolutivas para la subfamilia Haematosiphoninae: i) fusiones autosómicas que provocaron una reducción en el número de autosomas; ii) fragmentación del cromosoma X ancestral originando sistemas sexuales múltiples y iii) fragmentaciones autosómicas que trajeron aparejado un incremento en el número de autosomas. Acanthocrios furnarii y P. uritui poseen un alto contenido de heterocromatina, ubicada en ambas regiones terminales de cada uno de los autosomas del complemento, por lo cual las regiones cromosómicas que se repelen son heterocromáticas. En A. furnarii, los clusters de ADNr se localizan en una de las regiones terminales de un par autosómico, mientras que en P. uritui se ubican en una de las regiones terminales de un par autosómico y de uno de los cromosomas sexuales. En ambas especies la composición nucleotídica de los genes ribosomales es rica en pares de bases GC. Además del amplio rango en el número cromosómico en la familia, la localización de los genes de ADNr es muy variable, lo que permite sugerir que el genoma de los cimícidos presenta una gran dinámica, que podría deberse a diferentes mecanismos tales como la recombinación ectópica y/o la presencia de elementos transponibles. Las especies de Reduviidae estudiadas comparten características que son típicas de la familia e incluso de Heteroptera: los bivalentes autosómicos son quiasmáticos y se dividen reduccionalmente en anafase I; los cromosomas sexuales son heteropicnóticos positivos durante la profase I temprana, asinápticos, aquiasmáticos y se dividen ecuacionalmente en anafase I. Sin embargo, también se han observado diferencias y/o particularidades citogenéticas: i) las especies analizadas presentan una disposición cromosómica desordenada en metafase I, independientemente del número cromosómico y del sistema de cromosomas sexuales que posean, aunque en metafase II la arquitectura de la placa es la típica para los heterópteros; ii) la presencia de por lo menos un bivalente mayor con dos quiasmas es una característica frecuente en Reduviidae; además, estos bivalentes se comportarían como telocinéticos al liberarse primero uno de los dos quiasmas; iii) de acuerdo al comportamiento y las características meióticas del par menor hallado en M. lunifer , se propone que sea considerado como un par de cromosomas m. Hasta el presente Microtomus es el único género de Reduviidae que presenta este tipo de cromosomas. En cuanto a la evolución del cariotipo, se sugieren las siguientes tendencias evolutivas: i) la presencia de cromosomas m en Hammacerinae podría ser considerado como un carácter plesiomórfico; ii) las fusiones son más frecuentes que las fragmentaciones autosómicas; iii) las fragmentaciones en el cromosoma X y aún la pérdida del cromosoma Y aparecen en distintos grupos y de forma independiente. El análisis del contenido, localización y composición de heterocromatina sugieren que esta familia se caracterizaría por presentar un bajo contenido de heterocromatina constitutiva, preferentemente localizada en regiones terminales de los autosomas. En aquellas especies con bloques heterocromáticos terminales en algún bivalente autosómico, los quiasmas se ubicaron en zonas adyacentes, por lo que si bien muy probablemente no habría recombinación a nivel de heterocromatina, el efecto supresor de la recombinación no se extendería más allá de la región heterocromática en sí misma. La localización de los clusters de ADNr en Reduviidae fue también muy variable: en autosomas, en cromosomas sexuales o en ambos a la vez. En el par mayor de M. lunifer , G. bicolor y Z. obscuridorsis, la localización de ADNr fue utilizada como marcador cromosómico para analizar los sitios de actividad cinética, permitiendo sugerir que en las tres especies la elección de los extremos cinéticamente activos es un proceso azaroso en ambas divisiones meióticas y que aquellas regiones que fueron activas en la primera división meiótica son inactivas en la segunda y viceversa. Con el fin de analizar el grado de diferenciación molecular de los cromosomas sexuales utilizando técnicas citogenético-moleculares, se utilizó como modelo de estudio a R. prolixus y se implementó por primera vez en Cimicomorpha las técnicas de pintado cromosómico (CP), hibridación in situ de genoma (GISH) e hibridación comparativa de genoma (CGH). La técnica de CP sugiere que la estructura del genoma de R. prolixus posee un alto contenido de secuencias repetidas dispersas en el genoma. Por su parte, las técnicas de GISH y CGH fueron informativas al revelar que el cromosoma Y posee secuencias específicas de macho y que el cromosoma X no estaría enriquecido preferentemente en ADN de uno u otro sexo. Además, se pudo detectar un alto grado de diferenciación molecular entre los cromosomas sexuales X e Y en el sistema simple de R. prolixus. En este trabajo se describe una población polimórfica de Zelurus femoralis longispinis para el número de cromosomas, observándose dos citotipos (2n=22/23). El comportamiento del cromosoma extra altamente regular y similar al de los cromosomas sexuales y el hecho de encontrar que el largo promedio de los cromosomas sexuales en los individuos no portadores del cromosoma extra es significativamente mayor respecto a los que sí lo poseen, permiten concluir que: i) esta variante cariotípica es neutral o, al menos, no perjudicial, ii) su surgimiento no habría acontecido tan recientemente y iii) el cromosoma extra se habría originado por fragmentación del cromosoma X original, dando como resultado un sistema múltiple X1X2Y. El análisis de esta población sustenta la hipótesis del origen de los sistemas múltiples en Heteroptera. Por otra parte, se describió la presencia de un individuo de Triatoma infestans mutante espontáneo heterocigota para una fusión entre cromosomas no homólogos (2n=19A+cromosoma extra+XY, macho). A partir del análisis del comportamiento meiótico del mutante y del patrón de bandas C se propone que: i) el trivalente autosómico se divide ecuacionalmente en la primera división meiótica; ii) dos de los tres pares de autosomas mayores habrían estado involucrados en el evento de fusión; iii) el cromosoma extra se habría originado como producto de la fusión autosómica. La presencia de un mutante espontáneo en una población natural y el comportamiento masculino meiótico altamente regular constituyen evidencias a favor de la hipótesis que propone a las fusiones como uno de los mecanismos de evolución del cariotipo en Heteroptera. ; This PhD Thesis is based on the classical cytogenetic, molecular and evolutionary study of hematophagous and predatory insects of Cimicidae and Reduviidae families from Cimicomorpha (Hemiptera: Heteroptera), which are characterized by the presence of holokinetic chromosomes. Chromosome complement and meiotic development were analysed as well as the heterochromatin content, composition and distribution. Moreover, the number and location of ribosomal DNA genes were also analysed in the following species: Acanthocrios furnarii 2n=10A+XY/XX (male/female) and Psitticimex uritui 2n=28A+X1X2Y (male) (Cimicidae: Haematosiphoninae); Brontostoma colossus 2n=28A+XY (male) and B. discus 2n=34A+X1X2Y (male) (Reduviidae: Ectrichodiinae); Microtomus lunifer 2n=26A+2m+X1X2Y (male) (Reduviidae: Hammacerinae); Apiomerus lanipes 2n=22A+XY (male), Atrachelus (Atrachelus) cinereus 2n=26A+XY/XX (male/female), Cosmoclopius annulosus 2n=24A+X1X2X3Y/X1X1X2X2X3X3 (male/female), Graptocleptes bicolor 2n=22A+XY/XX (male/female) and Zelus obscuridorsis 2n=16A+XY/XX (male/female) (Reduviidae: Harpactorinae); Zelurus femoralis longispinis 2n=20A+XY/X1X2Y (male) (Reduviidae: Reduviinae); Rhodnius prolixus 2n=20A+XY/XX (male/female) and Triatoma infestans 2n=20A+XY (male) (Reduviidae: Triatominae). The classical cytogenetic analysis performed on A. furnarii and P. uritui shows that male meiosis in both species is achiasmatic and of collochores type, which could be considered a cytogenetic characteristic shared by members of Cimicidae family. However, A. furnarii and P. uritui have an own pattern of achiasmatic meiosis, in which three regions can be differentiated in autosomal bivalent: i) terminal regions found in repulsion, ii) half region where the chromosomes are located parallel but without contact and iii) small areas within the middle region where not chiasmatic attachment points or collochores are located. The analysed population of A. furnarii by other authors (2n=32A+XY, male) differs from the present description (2n=10A+XY, male). This remarkable difference in the diploid number of autosomes cannot be explained as polytypism, therefore we concluded that these two karyotypes belong to two different taxa. Based on the results described in this PhD Thesis and on the cytogenetic background available, it suggests the following evolutionary trends for the subfamily Haematosiphoninae: i) autosomal fusions that caused a reduction in the number of autosomes, ii) X ancestral chromosome fragmentation originating the derived system of multiple sex chromosomes and iii) autosomal fragmentations associated with an increase in the number of autosomes. Acanthocrios furnarii and P. uritui both possess high heterochromatin content, located in both end regions of each autosome wherefore chromosomal regions that repel are heterochromatic. In A. furnarii rDNA clusters are located on one of the terminal regions of an autosomal pair, whereas in P. uritui are located in one of the end regions of an autosomal pair and in one of the sex chromosomes. In both species, the nucleotide composition of the ribosomal genes is rich in GC base pairs. In addition to the wide range in the chromosome number in the family, the location of rDNA genes is very variable, which allows to suggest that the cimicid genome has a high dynamic. This could be due to diverse mechanisms such as ectopic recombination and/or to the presence of transposable elements. The Reduviidae species studied herein share characteristics that are typical of the family and also from Heteroptera: autosomal bivalents are chiasmatic and divide at anaphase I, the sex chromosomes are positively heteropycnotic during early prophase I, asynaptic, achiasmatic and divided equationally at anaphase I. However, it has also observed different cytogenetic features: i) the analysed species have a disordered arrangement in metaphase I, regardless of the chromosome number and the sex chromosome system they have, although in metaphase II the plate architecture is typical for the group of Heteroptera; ii) the presence of at least one large bivalent with two chiasmata is a frequent feature in Reduviidae. Furthermore, those bivalents should behave as telokinetic by releasing first one of the two chiasmata; iii) according to the behaviour and meiotic characteristics of the minute pair found in M. lunifer, it proposes that it should be considered as one pair of m chromosomes. Microtomus is at present the only reduvid genus which presents a pair of m chromosomes. Regarding karyotype evolution, it suggests the following evolutionary trends: i) the presence of m chromosomes in Hammacerinae could be considered as a plesiomorphic character, ii) fusions are more common than autosomal fragmentations, iii) fragmentations on the X chromosome and even the loss of the Y chromosome appear in different groups and in an independent way. Analyses of content, location and composition of heterochromatin suggest that this family is characterized by a low content of constitutive heterochromatin, mainly located in terminal regions of the autosomes. In those species with terminal heterochromatic blocks in any autosomal bivalent, chiasmata were located in adjacent areas. Therefore, although there would not probably be recombination at heterochromatin level, the suppressive effect of recombination would not extend beyond the heterochromatic region itself. The rDNA clusters location was also highly variable in Reduviidae: on autosomes, on sex chromosomes, or in both simultaneously. In the largest autosomal pair of M. lunifer , G. bicolor and Z. obscuridorsis, the location of rDNA was used as a chromosomal marker to analyse sites of kinetic activity, suggesting that, in the three analysed species, the kinetic activity of both ends is not a random process and there is an inversion of this activity. In order to analyse of molecular differentiation in sex chromosomes by molecular cytogenetic techniques, R. prolixus was used as a model of study. Chromosome painting (CP), genome in situ hybridization (GISH) and comparative genome hybridization (CGH) were used for the first time in Cimicomorpha. CP technique suggests that the genome structure of R. prolixus has a high content of dispersed repeated sequences. On the other hand, GISH and CGH techniques were informative and revealed that the Y chromosome has male-specific sequences, whereas the X chromosome would not be enriched preferably in either sex DNA. In addition, it could also detect a high degree of molecular differentiation between X and Y sex chromosomes in the simple system of R. prolixus . In the present PhD Thesis, a polymorphic population of Zelurus femoralis longispinis for the chromosomal number has been described, being observed two cytotypes (2n=22/23). The behaviour of the extra chromosome highly regular and similar to sex chromosomes and finally, the finding that the average length of the sex chromosomes in individuals not carrying the extra chromosome is significantly greater than in those who do have, allow to conclude: i) this new chromosome complement is neutral or at least not harmful, ii) its origin would not have occurred so recently and iii) the extra chromosome should be originated by fragmentation of the original X chromosome, resulting in a multiple system X1X2Y. The analysis of this population supports the hypothesis of the multiple sex systems origin in Heteroptera. Moreover, the presence of a spontaneous mutant heterozygous of Triatoma infestans carrying a fusion between non-homologous chromosomes has been described (2n=19A+extra chromosome+XY, male). Taking into account its meiotic behaviour together with the results of the C-banding pattern, allow to propose that: (i) the autosomal trivalent divides equationally during the first meiotic division, ii) two of the largest pairs of autosomes might have been involved in the fusion event and (iii) the extra chromosome was originated as a product of the autosomal fusion. The presence of a spontaneous mutant in a natural population and the highly regular meiotic male behaviour are evidences that favour the hypothesis that fusion as one of the mechanisms of karyotype evolution in Heteroptera. ; Fil:Poggio, María Georgina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.