HSP-Antigen-Fusionsproteine als Tumor-Vakzinen in der Maus

Abstract

Hitze-Schock-Proteine (HSP) sind bekannt dafür, die Kreuzpräsentation von Antigenen in dendritischen Zellen (DC) zu induzieren sowie DC zu aktivieren (Adjuvans-Effekt). Diese Eigenschaften machen HSP-Antigen-Komplexe zu geeigneten Kandidaten, um antigenspezifische CD8+ T-Zellen-Antworten gegen Tumor-assozierte-Antigene zu initiieren. Es gibt ca. 15-20 verschiedene HSP, aber bis jetzt ist wenig über ihre relativen immunologischen Eigenschaften (Aktivierung des Immunsystems und Kreuzpräsentation) bekannt. In dieser Arbeit wurden verschiedene HSP der HSP70-Familie (M.tuberculosis Hsp70, murines induzierbares Hsp70, murines Hsp70L1 und murines konstitutiv exprimiertes Hsc70) verglichen, die an ein Fragment von Ovalbumin (OVA) als Modell-Tumor-Antigen fusioniert wurden. Selbst geringe Mengen (100 pmol) an in E.coli hergestellten rekombinanten Hsp70-OVA konnten effiziente Antworten von OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen in Kurzzeitimmunisierungen in vivo hervorrufen. Im direkten Vergleich der hier untersuchten vier Hsp70-Typen zeigte sich M.tuberculosis Hsp70 (mtubHsp70) als das HSP mit der stärksten Immunogenität. Die Immunisierung mit Hsp70-OVA war abhängig von DC, da nach Depletion der DC in CD11c.DTR Mäusen keine CD8+ T-Zell-Antworten mehr beobachtet werden konnten. Die Immunisierung mit mtubHsp70-OVA führte zu einer signifikanten zytotoxischen Aktivität in vivo, während die Immunisierung mit dem Fusionsprotein ohne Hsp-Anteil (rekombinantes OVA-Fragment) zu keiner Zytotoxizität führte. Um zu untersuchen, ob die starken immunostimulatorischen Fähigkeiten des HSP-Anteils (Adjuvans-Effekt) durch Endotoxin-Kontamination zustande kamen, wurden die Versuche in LPS-Rezeptor (TLR4)-defizienten Mäusen wiederholt. In diesen Mäusen konnte die Immunisierung mi mtubHsp70-OVA nur eine schwache Zytotoxizität induzieren. Nach Endotoxin-Abreicherung der Hsp70-OVA Präparate konnte keine zytotoxische Aktivität nach einmaliger Immunisierung von Wildtyp-Mäusen gemessen werden. Folglich scheint die Endotoxin-Kontamination wesentlich zu der Immunogenität der rekombinanten Hsp70-OVA-Fusionsproteine beizutragen. Mehrfache Immunisierung mit Endotoxin-freiem Hsp70-OVA führte zu einer zytotoxischen Aktivität in vivo und konnte signifikant das Wachstum eines OVA-exprimierenden B16 Melanoms verlangsamen. Auch die einmalige Immunisierung mit Endotoxin-abgereichertem Hsp70-OVA in Kombination mit geringen Mengen TLR9-Ligand CpG-Oligodesoxynukleotid 1668 führte zu ähnlichen Ergebnissen in der in vivo Zytotoxizität und in der Anti-Tumorimmunität. Allerdings konnte kein signifikanter Unterschied in der Stärke der Immunantworten zwischen Endotoxin-abgereichtem Hsp70-OVA und Endotoxin-abgereichtem rekombinantem OVA-Fragment gefunden werden. Im Gegensatz zu rekombinantem OVA-Fragment war aber kommerziell erhältliches Ovalbumin aus Hühnereiweiß ein sehr schwaches Antigen. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass die starke Aggregation der Fusionsproteine wichtig für den Erfolg der Vakzinierung ist, da Hitze-Aggregierung von kommerziell erhältlichem Ovalbumin zu gleich starken Immunantworten wie die Immunisierung mit Endotoxin-abgereichertem Hsp70-OVA und rekombinantem OVA-Fragment führte. Unter nativen Bedingungen aufgereinigtes, Endotoxin-abgereichertes Hsp70-OVA induzierte keine signifikanten zytotoxischen Immunantworten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass der bisher beobachtete Adjuvans-Effekt des Hsp70-Anteil der Fusionsproteine durch die Endotoxin-Abreicherung weitgehend verloren geht. Folglich scheinen Endotoxin-abgereicherte Hsp70-OVA-Proteine keine erhöhte Fähigkeit im Vergleich zum Antigen ohne HSP-Anteil zu besitzen, zytotoxische und teilweise tumorprotektive T-Zell-Antworten zu induzieren. Daher erscheinen Endotoxin-freie Hsp70-Antigen-Fusionsproteine ungeeignet, eine starke Anti-Tumorimmunität zu induzieren. Andererseits konnte gezeigt werden, dass die Aggregation des Antigens zu einer deutlichen Verstärkung der Immunogenität führt. Diese kann auf die verstärkte Kreuzpräsentation der aggregierten Proteine zurückgeführt werden. In Kombination mit einem starken Adjuvans (hier CpG-ODN) konnte eine signifikante Anti-Tumorimmunität induziert werden.