Suchergebnisse

The study's purpose was the developing of the method for Acinetobacter nosocomialis bacteria identification by the totality of phenotypic characteristics of the Acinetobacter baumannii (Ab) group based on the urease activity trait.The research's objects were clinical strains of the Ab group, isolated in 2018—2019 in the bacteriological laboratory of Kirov Military Medical Academy (St. Petersburg), of which were A. baumannii (n = 85), A. nosocomialis (n = 12), A. pittii (n = 10). In addition, 9 strains of A. nosocomialis were isolated from water samples from the Neva River and 2 strains of A. calcoaceticus from the cyanobacterial mats. The belonging of the strains to Ab group was determined by the combination of the metabolic and physiological characteristics of the taxonomic tests for this group. The species identification of the studied strains was determined by the matrix-associated laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). The urease activity of bacteria was determined using the microvolume method. We used a medium with urea in the following composition (g/l): Na2HPO4 — 1.1; KH2PO4 — 1.1; NaCI — 5.0; 40% alkaline solution phenol red — 5 ml; urea — 10—15; distilled water — 1 l. The ingredients, without urea, were dissolved in distilled water, dispensed to vials, sterilized for 20 minutes at 121°C, urea was added in the calculated amount. The medium with urea was added in 0.1 ml to wells of the plate, then inoculated the daily agar culture of the studied and control strains by full loop (2 mm in diameter) and incubated under aerobic conditions at 37°C. The reaction results for a rapid urease activity were determined after 3 hours by a change in the initial color of the medium. The reactions were accounted after 7—24 hours to detect activity urease. It was found that 100% of A. nosocomialis strains and 18.82% of A. baumannii strains had urease activity. At the same time, high activity urease was found only in one strain of A. baumannii (1.17%) and in all strains of A. nosocomialis. Therefore, the presence of high urease activity is of taxonomic importance for the species A. nosocomialis as the marker of distinguishing this species from other bacteria species of the Ab group. The sensitivity and specificity of the identifying A. nosocomialis strains by suggested approach compared to the studied strains identification by MALDI-TOF MS were 100 and 98.83% (x2 = 103.2; p < 0.0001), respectively. ; Цель исследования — разработка способа идентификации бактерий вида Acinetobacter nosocomialis по совокупности фенотипических признаков группы Acinetobacter baumannii (Ab) с использованием признака уреазной активности. Объектами исследования были клинические штаммы группы Ab, выделенные в 2018—2019 гг. в бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург), из них A. baumannii — 85, A. nosocomialis — 12, A. pittii — 10 штаммов. Еще 9 штаммов A. nosocomialis были выделены из воды реки Невы и 2 штамма A. calcoaceticus — из цианобактеральных матов. Принадлежность штаммов к группе Ab устанавливали по совокупности метаболических и физиологических признаков таксономическими тестами для данной группы. Видовая принадлежность всех штаммов была установлена методом матрично-ассоциированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Уреазную активность бактерий определяли микрообъемным методом. Использовали среду с мочевиной следующего состава (г/л): Na2HPO4 — 1,1; KH2PO4 — 1,1; NaCI — 5,0; 0,4%-ный водно-щелочной раствор фенолового красного — 5 мл; мочевина — 10,0—15,0; вода дистиллированная — 1 л. Ингредиенты, кроме мочевины, растворяли в дистиллированной воде, разливали во флаконы, стерилизовали 20 мин при 121°С, затем добавляли во флаконы мочевину в расчетном количестве. Среду с мочевиной вносили по 0,1 мл в лунки планшета, затем засевали по полной петле (диаметром 2 мм) суточной агаровой культуры исследуемых и контрольных штаммов и инкубировали в аэробных условиях при 37°С. Результаты реакции на уреазу быстрой активности учитывали через 3 часа инкубации по изменению исходной окраски среды. Для выявления уреазы слабой активности реакцию учитывали через 7—24 часа. Было установлено, что у бактерий группы Ab уреазную активность имели 100% штаммов A. nosocomialis и 18,82% штаммов A. baumannii. При этом уреазу быстрой активности имели все штаммы A. nosocomialis и только один штамм A. baumannii (1,17%). Следовательно, уреаза быстрой активности имеет таксономическое значение как маркер бактерий вида A. nosocomialis, отличающий этот вид от других видов группы A. baumannii. Чувствительность и специфичность указанного способа идентификации бактерий вида A. nosocomialis относительно идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии составили 100 и 98,83% (х2 = 103,2; p < 0,0001).

The aim of the study was to carry out clinical and microbiological testing of selective growth medium Acinetobacter phenylalanine agar to isolate and identify bacterial species belonging to the Acinetobacter calcoaceticus — Acinetobacter baumannii complex (ACB complex). For this, 400 samples of clinical material (wound discharge, blood, urine, bronchoalveolar lavage) were examined in 2018 in the Clinical and Bacteriological Laboratory of the Military Medical Academy by using routine assays (seeding on blood agar growth medium, pure culture isolation and identification by using biochemical assays as well as VITEK 2 microbial identification system, bioMerieux) and plating together with growth medium Acinetobacter phenylalanine agar selective to Acinetobacter spp. owing to L-phenylalanine as a sole nitrogen and carbon source additional selected with trimethoprim. ACB complex Acinetobacters were identified 18–24 hours later after incubation at 37°C by emergence of typical colonies on selective medium. Control tests for cytochrome oxidase as well as oxidative/fermentation (OF)-glucose test by using peroxide-hydrogen microvolume method (for 1 h) allowed to rapidly distinguish ACB complex Acinetobacters from other bacteria as well as from Acinetobacter spp. unable to glucose oxidation. Next, species identity for all isolated Acinetobacter strains was established by using matrix-activated laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). It was found that by using novel vs. routine assay Acinetobacter spps. were isolated in 26 (18 samples — in monoculture, 8 — in association with Pseudomonas aeruginosa or Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae with tiny associate colonies) vs. 20 (7 — in monoculture, 13 — in association with Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Escherichia, Citrobacter, Providencia, Staphylococcus, Enterococcus, C. albicans). Using MALDI-TOF MS method revealed that 25 out of 26 Acinetobacter strains isolated on selective growth medium belonged to the ACB complex (A. baumannii — 23, A. pittii — 2), whereas one strain (A. baylyi) did not belong to ACB complex. Hence, the diagnostic specificity of the Acinetobacter phenylalanine agar synthetic growth medium for isolation and identification of the A. calcoaceticus — A. baumannii complex species comprised 96.2%, with diagnostic sensitivity exceeding that one for routine assay by 25%. Use of selective growth medium accelerates research by allowing to isolate and identify ACB complex Acinetobacter spp. 18–24 h later after plating clinical material. Selectivity of growth medium was potentially stable, as its major trophic selection factor did not depend on acquired bacterial antibiotic resistance, which is also suitable as a synthetic growth medium for standardized studies. ; Цель исследования — клинико-микробиологическая апробация селективной питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus — Acinetobacter baumannii (комплекса АСВ). В 2018 г. клинико-бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии были изучены 400 проб клинического материала (отделяемое ран, кровь, моча, бронхо-альвеолярные смывы) параллельно традиционным методом [посев на кровяной агар, выделение и идентификация чистых культур биохимическими тестами и микробиологическим анализатором «Vitek 2» (bioMerieux)] и посевом на чашки с питательной средой «Ацинетобактер фенилаланин агар». Селективность этой среды обусловлена трофической селекцией ацинетобактеров L-фенилаланином в качестве единственного источника азота и углерода и дополнительной селекцией триметопримом. Ацинетобактеры комплекса АСВ идентифицировали через 18–24 ч инкубации при 37°С по наличию характерных колоний на селективной среде. Контрольные тесты на цитохромоксидазу и ОФ-тест с глюкозой пероксидводородным микрообъемным методом (в течение 1 ч) позволяли в экспресс-режиме отличать ацинетобактеры комплекса АСВ от других бактерий и группы ацинетобактеров неокисляющих глюкозу. Далее определяли вид всех выделенных штаммов ацинетобактеров методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS). Ацинетобактеры были выделены на селективной среде в 26 пробах (18 проб в монокультуре, 8 — в ассоциации с Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae при очень мелких колониях ассоциантов); традиционным методом — в 20 пробах (7 — в монокультуре, 13 — в ассоциациях с синегнойной палочкой, клебсиеллами, эшерихиями, цитробактером, провиденциями, стафилококками, энтерококками, C. albicans). Методом MALDI-TOF MS было установлено, что из 26 штаммов ацинетобактеров, выделенных на селективной среде, 25 относятся к комплексу АСВ (A. baumannii — 23, A. pittii — 2). Один штамм (A. baylyi) не относился к видам комплекса АСВ. Следовательно, диагностическая специфичность селективной синтетической питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» по выделению и идентификации бактерий комплекса A. calcoaceticus — A. baumannii составляет 96,2%, а ее диагностическая чувствительность превышает на 25% традиционный метод. Применение селективной среды ускоряет исследование — выделение и идентификация ацинетобактеров комплекса АСВ завершается через 18–24 ч после посева клинического материала. Селективность питательной среды потенциально стабильна, так как ее основной трофический фактор селекции не зависит от приобретенной антибиотикоустойчивости бактерий. Как синтетическая питательная среда она пригодна для стандартизованных исследований.

The aim of the study was to determine the taxonomic status of a group consisting of atypical strains of Acinetobacter baumannii, outline relevant characteristics and methods necessary for their identification. There were examined 10 strains of A. baumannii (6 of them primary comprised) bearing similar profile of atypical features isolated from clinical samples (urine, sputum) in 2017–2019 at the Military Medical Academy. Сlinical strains of typical A. baumannii (n = 36), Acinetobacter nosocomialis (n = 14), Acinetobacter pittii (n = 9) and 1 strain of Acinetobacter calcoaceticus isolated from the external environment were used in comparative studies. Atypical strains had the characteristics of A. calcoaceticus — A. baumannii (ACB) complex bacteria and were identified as A. baumannii. The utilization of substrates as the only carbon source was studied on a dense synthetic medium added with 0.2 % substrate during incubation for 72 hours at 37°C. Carbohydrate oxidation coupled to acid formation was detected on the Hugh–Leifson medium by using a micromethod. Aromatic amino acid biotransformation was carried out in liquid and dense nutrient media assessed in chromogenic reaction. The rpoB gene was used for strain genetic characterization. Amplification of two 940 and 1210 base pair (bp)-long fragments from the rpoB gene was performed by the routine polymerase chain reaction using primers with previously described sequences. Amplification products were sequenced by Sanger using Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, USA) and capillary electrophoresis on an automatic sequencer ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, USA), followed by using methods for determining the similarity levels of sequenced fragments with the rpoB gene sequences of the reference strain A. baumannii ATCC 17978 (GenBank accession no. CP053098.1). It was found that all strains belonging to atypical A. baumannii spp. had a specific set of features that distinguish them from typical strains of A. baumannii as well as other types of the ACB complex: detected biotransformation of L-tryptophan (via anthranilate pathway) and anthranilic acid under unambiguous lack of such signs in other bacteria; lack of utilized sodium hippurate and L-arabinose being unambiguously evident in other bacteria; lack of utilized L-tryptophan, putrescine, L-ornithine being utilized in the majority of strains of belonging to other bacterial species. Genetic analysis showed that the control strains of typical A. baumannii displayed 99.20–99.21% similarity within the sequenced fragments of the rpoB gene with those from the rpoB gene of the reference strain. All 10 strains of atypical A. baumannii had similar features (99.20–99.21%). At the same time, parameters of control strains from other bacterial species significantly differed: A. nosocomialis (95.10–95.97%), A. pittii (94.63–94.92%), A. calcoaceticus (93.00%). Hence, the strains of atypical and typical A. baumannii are genetically homogeneous and belong to the same species. The data presented allow us to consider this group of atypical A. baumannii strains as a new biovar. We propose the name for this new biovar — tryptophandestruens (tryptophan-destroying) stemming from the Latin word destruens — destroying. Identification of A. baumannii bv. tryptophandestruens bacteria can be carried out in laboratory of any level by using tests for L-tryptophan biotransformation as well as sodium hippurate utilization. ; Цель исследования — определить таксономический статус группы атипичных штаммов Acinetobacter baumannii, выявить их характеристики и методы, необходимые для идентификации. Объектом исследования были 10 штаммов A. baumannii (из них 6 первичных), имеющих одинаковый профиль атипичных признаков. Они были выделены из клинического материала (моча, мокрота) в 2017–2019 гг. в Военно-медицинской академии. В сравнительных исследованиях использовали клинические штаммы типичных A. baumannii (n = 36), Acinetobacter nosocomialis (n = 14), Acinetobacter pittii (n = 9) и 1 штамм Acinetobacter calcoaceticus, выделенный из внешней среды. Атипичные штаммы обладали признаками бактерий комплекса A. calcoaceticus — A. baumannii (ACB) и были идентифицированы как A. baumannii. Утилизацию субстратов в качестве единственных источников углерода изучали на плотной синтетической среде с 0,2% субстрата при инкубации посевов 72 часа при 37°C. Окисление углеводов с кислотообразованием выявляли на среде Хью–Лейфсона и микрометодом. Биотрансформацию ароматических аминокислот осуществляли в жидких и плотных питательных средах по хромогенной реакции. Для генетической характеристики штаммов использовали ген rpoB. Амплификацию двух фрагментов гена rpoB длиной 940 п. н. и 1210 п. н. проводили методом стандартной полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, имеющих описанные ранее последовательности. Продукты амплификации секвенировали по Сэнгеру с использованием BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США) и капиллярного электрофореза на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) с последующим применением методов определения уровней сходства секвенированных фрагментов с последовательностями гена rpoB референс-штамма A. baumannii ATCC 17978 (GenBank acc. no. CP053098.1). Было установлено, что все штаммы группы атипичных A. baumannii имели специфическую совокупность признаков, отличающих их от типичных штаммов A. baumannii и других видов комплекса АСВ: наличие биотрансформации L-триптофана (антранилатным путем) и антраниловой кислоты при однозначном отсутствии этих признаков у других бактерий; отсутствие утилизации гиппурата натрия и L-арабинозы при однозначном наличии утилизации у других бактерий; отсутствие утилизации L-триптофана, путресцина, L-орнитина при наличии утилизации у большинства штаммов других видов. Генетический анализ показал, что контрольные штаммы типичных A. baumannii имели 99,20–99,21% сходства последовательностей секвенированных фрагментов гена rpoB с последовательностями гена rpoB референсного штамма. Такие же показатели имели все 10 штаммов атипичных A. baumannii (99,20–99,21%). При этом показатели контрольных штаммов других видов достоверно отличались: A. nosocomialis — 95,10–95,97%, A. pittii — 94,63–94,92%, A. calcoaceticus — 93,00%. Следовательно, штаммы атипичных и типичных A. baumannii генетически однородны и принадлежат к одному виду. Представленные факты позволяют считать данную группу атипичых штаммов A. baumannii новым биоваром. Предлагаем название новому биовару: tryptophandestruens (триптофанразрушающий) (лат. destruens — разрушаю щий). Идентификацию бактерий A. baumannii bv. tryptophandestruens можно осуществлять в лабораториях любого уровня тестами на биотрансформацию L-триптофана и утилизацию гиппурата натрия.