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AbstractTests with zebrafish embryos have gained wide acceptance as an alternative test model for drug development and toxicity testing. In particular, the behavioral response of the zebrafish embryo is currently seen as a useful endpoint to diagnose neuroactive substances. Consequently, several behavioral test methods have been developed addressing various behavioral endpoints such as spontaneous tail coiling (STC), photomotor response (PMR), locomotor response (LMR) and alternating light/dark-induced locomotor response (LMR-L/D). Although these methods are distinct in their application, most of their protocols differ quite strongly in the use of experimental parameters and this is usually driven by different research questions. However, if a single mode of action is to be diagnosed, then varying experimental parameters may cause incoherent behavioral responses (hypo- or hyperactivity) of zebrafish during toxicity assessment. This could lead to inconclusiveness of behavioral test results for use within a prospective and diagnostic risk assessment framework. To investigate the influence of these parameters, we conducted a review of existing behavioral assays to address the following two questions: (1) To what extent do varying experimental parameters influence observed effects in published behavioral test methods? (2) Is the observed behavior change (hypo- or hyperactivity) of zebrafish embryos consistent with the expected mode of action of a chemical? We compiled a set of 18 substances which are anticipated to be neuroactive. We found that behavioral changes are not only affected by chemicals but also variation in the use of experimental parameters across studies seems to have a high impact on the outcome and thus comparability between studies. Four parameters, i.e., exposure concentration, exposure duration, endpoint parameter and developmental stage were the most influential parameters. Varying combinations of these parameters caused a non-reproducible outcome for the hyperactivity expected for the organophosphates; chlorpyrifos and diazinon. We highlighted that the STC test shows a higher capacity to predict the hyperactivity of organophosphates, while PMR and LMR-L/D were more suitable to predict the hypoactivity expected for anticonvulsants. We provide a list of recommendations which, when implemented, may help to exclude the risk of bias due to experimental parameters if similar goals are desired.

AbstractAcetylcholinesterase (AChE) inhibitors are an important class of neuroactive chemicals that are often detected in aquatic and terrestrial environments. The correct functionality of the AChE enzyme is linked to many important physiological processes such as locomotion and respiration. Consequently, it is necessary to develop new analytical strategies to identify harmful AChE inhibitors in the environment. It has been shown that mixture effects and oxidative stress may jeopardize the application of in vivo assays for the identification of AChE inhibitors in the environment. To confirm that in vivo AChE assays can be successfully applied when dealing with complex mixtures, an extract from river water impacted by non-treated wastewater was bio-tested using the acute toxicity fish embryo test (FET) and AChE inhibition assay with zebrafish. The zebrafish FET showed high sensitivity for the extract (LC10 = relative extraction factor 2.8) and we observed a significant inhibition of the AChE (40%, p < 0.01) after 4-day exposure. Furthermore, the extract was chromatographically fractionated into a total of 26 fractions to dilute the mixture effect and separate compounds according to their physico-chemical properties. As expected, non-specific acute effects (i.e., mortality) disappeared or evenly spread among the fractions, while AChE inhibition was still detected in five fractions. Chemical analysis did not detect any known AChE inhibitors in these active fractions. These results confirm that the AChE assay with Danio rerio can be applied for the detection of neuroactive effects induced in complex environmental samples, but also, they highlight the need to increase analytical and identification techniques for the detection of neurotoxic substances.

Die Pilotphase Kleingewässermonitoring konnte als drittes Teilvorhaben zur "Umsetzung des Nationalen Aktionsplan zur nachhaltigen Anwendung von Pflanzenschutzmitteln (PSM)" erfolgreich als zweijähriges Monitoring umgesetzt werden. Es wurden für mehr als 100 Fließgewässerabschnitte in 13 Bundesländern umfassend der chemische und biologische Zustand kleiner Fließgewässer in der Agrarlandschaft zwischen April und Juli erfasst. Zusätzlich zu Schöpfproben analog zu dem behördlichen Monitoring nach Wasserrahmenrichtlinie (WRRL) wurden ereignisbasierte Wasserproben genommen, um kurzfristige Peakkonzentrationen infolge von Niederschlägen zu erfassen. Zudem wurden anthropogene Stressoren wie Gewässerstruktur, Nährstoffe und Sauerstoffdefizite hochaufgelöst aufgenommen. Die biologische Untersuchung umfasste die Beprobung der aquatischen Invertebraten- und Algengemeinschaft sowie eine Untersuchung der Ökosystemfunktion in den Kleingewässern. Die Ergebnisse zeigen, dass die im Rahmen des Zulassungsverfahrens von PSM festgelegten RAK-Werte (Regulatorisch Akzeptablen Konzentrationen) an über 73 % der untersuchten Standorte für mindestens einen PSM-Wirkstoff überschritten wurden. Besonders die Ereignisproben infolge von Regenereignissen wiesen erhöhte Konzentrationen auf, die durch Schöpfproben nicht erfasst wurden. Diese Belastungen korrelieren auch mit der ökologischen Situation der Gewässer. So erfüllt der Großteil (über 80 %) der untersuchten Fließgewässerabschnitte anhand des SPEARpesticides-Index nicht die Qualitätskriterien für einen guten Zustand. Die Pilotphase Kleingewässermonitoring zeigt, dass eine realistische Bewertung und regulatorische Nutzung eines Monitorings von PSM-Rückständen in kleinen Gewässern nur dann erfolgen kann, wenn auch erhöhte Einträge infolge von Niederschlagsereignissen berücksichtigt werden. Weiterhin treten auch unterhalb der bestehenden RAK-Werte ökologische Effekte im Gewässer auf, so dass sich die Frage nach der Protektivität der aus Labordaten abgeleiteten RAK-Werte stellt. Die Daten der ermittelten PSM-Belastung der kleinen Gewässer in der Agrarlandschaft werden dazu beitragen, Ursachen für die regelmäßige Überschreitung der bestehenden Grenzwerte zu ermitteln und Schwächen der bisherigen Risikobewertung aufzudecken. Ziel wird sein, auf dieser Basis Möglichkeiten zur Reduzierung der Einträge zu erarbeiten und regulatorische Konsequenzen zu ziehen. Siehe dazu auch Liess et al. (2021) und Weisner et al. (2021).