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Im Rahmen des durch die Europäische Union geförderten FACTT-Projektes (To promote Familiarization with and Acceptance of Crops incorporating Transgenic Technology in modern Agriculture) wurden in den Jahren 1996/97 und 1997/98 an zwei Standorten in Deutschland Versuche mit transgenen herbizidtoleranten (Wirkstoff Glufosinat, Herbizid Basta) Winterrapshybridzuchtstämmen durchgeführt, um Leistungsvermögen und Unkrautmanagement zu bewerten. Die transgenen Hybriden konnten höhere Erträge gegenüber den konventionellen Sorten Express und Capitol realisieren. Teilweise waren die Ertragsunterschiede im Vergleich zu der konventionellen Sorte Mohican und der Verbundhybride Synergy gering. Damit entspricht das Leistungspotential der geprüften transgenen Hybriden dem der zugelassenen Hybridsorten. In allen Versuchen wurden durch die transgenen Hybriden hohe bis sehr hohe Ölgehalte erreicht. Die herbizide Wirkung der verschiedenen Unkrautbekämpfungsmaßnahmen variierte in Abhängigkeit von den Auflaufbedingungen für die Unkräuter, der Witterung im Herbst und Winter, dem Wirkungsspektrum der Herbizide sowie dem Termin der Wirkungsermittlung. Die Herbizidbehandlung führte nur in einem von vier Versuchen zu signifikanten Mehrerträgen. Ertrag und Qualität wurden durch die einzelnen Unkrautbekämpfungsmaßnahmen nicht unterschiedlich beeinflusst. Für die optimale Ausschöpfung der Möglichkeiten des Systems HT-Raps/komplementäres Herbizid sind noch genauere quantitative Kenntnisse über Faktoren, die die Wirksamkeit des Herbizides bei der Anwendung in HT-Rapsbeständen einschränken bzw. begünstigen, erforderlich. ; In the framework of the FACTT project (To promote Familiarization with and Acceptance of Crops incorporating Transgenic Technology in modern Agriculture) promoted by the European Commission trials with transgenic herbicide tolerant (active substance glufosinate, herbicide Basta) hybrid strains of winter oilseed rape were carried out at two locations in Germany in 1996/97 and 1997/98 to evaluate yield performance and weed ...

Die Biotechnologie reicht bis in die Anfänge der Geschichte des modernen Menschen zurück. Der Mensch hat Bakterien und Pilze entdeckt, die Lebensmittel umwandeln oder haltbar machen, oder medizinische Wirkstoffe (z. B. Antibiotika) produzieren. Die moderne Biotechnologie wird gerne in die Bereiche Medizin, Agrar sowie Industrie eingeteilt. Die Pflanzenbiotechnologie begann mit der Zell- und Gewebekultur und wird heute mit der Übertragung von fremden Genen in Pflanzen assoziiert, auch als "grüne Gentechnik" bezeichnet. Während die erste Generation von gentechnisch veränderten (transgenen) Pflanzen hinsichtlich Integration, Expression und Vererbung der übertragenen Gene überprüft wurde, berücksichtigte die zweite Generation bereits wirtschaftlich wichtige Merkmale wie Herbizid-, Trockenheit- und Salztoleranz, Insektenresistenz, sowie Wuchseigenschaften. Mit der dritten Generation transgener Pflanzen wurden methodische Optimierungen sowie aktuelle ökologische und umweltpolitische Themen aufgegriffen. Wie können Pflanzen effizienter die immer knapper werdenden Nährstoffe effizienter nutzen? Wie können sie fit für den bevorstehenden Klimawandel gemacht werden? Können Pflanzen Erdölbasierte Rohstoffe herstellen? Sind Pflanzen in der Lage, recycelbare oder kompostierbare Biokunststoffe herzustellen? Können Pflanzen als Bioreaktoren oder Biofabriken für die kostengünstige Herstellung von Biokraftstoffen, Pharmazeutika und Medikamente dienen? Neue Entwicklungen in der Molekulargenetik und Genomsequenziertechnik bieten Perspektiven für eine verbesserte Erzeugung von Nahrungs- und Nutzpflanzen ("Next generation" Pflanzenbiotechnologie). ; Biotechnology dates back to the beginnings of the history of the modern humans. They have discovered that bacteria and fungi convert or preserve food, or produce medical drugs (such as antibiotics). Modern biotechnology is divided into the areas of medicine, agriculture and industry. The plant biotechnology began with cell and tissue culture, and nowadays is associated with the transfer of foreign genes into plants, also known as 'green gene technology'. The first generation of genetically modified (transgenic) plants was investigated with respect to integration, expression and inheritance of the foreign genes, while the second generation already comprised economically important characteristics such as herbicide, drought and salt tolerance, insect resistance, and growth properties. With the third generation of transgenic plants, methodological optimisations as well latest ecological and environmental issues were picked-up. How can plants more efficiently use the increasingly scarce nutrients? How can they be made fit for the forthcoming climate change? Can plants form oilbased raw materials? Are plants able to produce recyclable or compostable bioplastics? Can plants serve as bioreactors or bio-factories for the cost-effective production of biofuels, pharmaceuticals and medicines? New developments in molecular genetics and genome sequencing techniques offer a prospective for improved production of food crops (next generation plant biotechnology).

Die koronare Herzerkrankung und der Myokardinfarkt gehören in den Industrienationen zu den Haupttodesursachen. Trotz großen technischen Aufwandes mittels interventioneller Katheteruntersuchungen und einer Vielzahl pharmakologischer Behandlungsoptionen bleibt dieses Krankheitsbild angesichts der hohen Prävalenz von gesundheitspolitischer und sozioökonomischer Relevanz. Diese Arbeit möchte zum weiteren Verständnis von Regulationsmechanismen auf zellulärer Ebene beitragen und untersucht daher den Einfluss von lymphoid enhancer factor 1 (Lef-1) und der Protein-Kinase B (PKB) auf Hypertrophie und Zellzyklusaktivität von perinatalen Kardiomyozyten im transgenen Mausmodell. Die Auswertung ergibt für konstitutiv-aktives Lef (Lef-CA) in erster Linie einen Einfluss auf Zellhypertrophie durch eine Zunahme des Zellvolumens und des relativen Herzgewichts. Zudem kann auf molekularer Ebene ein Anstieg von Cyclin D3 beobachtet werden. Unter aktivierter PKB hingegen zeigt sich insbesondere ein Einfluss auf die extrazelluläre Matrix durch einen vermehrten Anteil an Gefäßendothel, interstitiellem Kollagen und Gesamtkollagen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die gezielte Aktivierung von Lef oder PKB in den Herzen von neonatalen Mäusen in vivo zu differenten Auswirkungen auf die Zellzyklusaktivität und die Komposition der Extrazellulärmatrix führt. ; Coronary heart disease and myocardial infarction are among the leading causes of death in industrialized countries. Despite significant technical advances of interventional catheter examinations and a variety of pharmacological treatment options, the disease remains relevant for health policy and socioeconomics due to its prevalence. This work aims to further the understanding of regulatory mechanisms at the cellular level and thus investigates the influence of lymphoid enhancer factor 1 (Lef-1) and protein kinase B (PKB) on hypertrophy and cell cycle activity of perinatal cardiomyocytes in the transgenic mouse model. Evaluation for constitutively-active Lef (Lef-CA) ...

Eines der wichtigsten Ziele gentechnologischer Arbeiten ist die Erzeugung transgener Kulturpflanzen ohne die Verwendung von Selektionsmarkergenen. Die Selektion transgener Zellen erfolgt beim Apfel (Malus x domestica BORKH.) in der Regel im Anschluss an einen Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit dem nptII/Kanamycin-System. Im Oktober 2002 wurde eine neue EU-Freisetzungsrichtlinie (2001/18/EG) rechtskräftig. Im Rahmen dieser Richtlinie ist vorgesehen, dass die Verwendung von Markergenen, insbesondere von Antibiotikaresistenzgenen, eingeschränkt werden soll. Das bedeutet, dass die Freisetzung gentechnisch modifizierter Organismen, welche beispielsweise das nptII-Gen als Selektionsmarker enthalten, unzulässig ist. Aus diesem Grund ist die Etablierung alternativer Selektionsstrategien zwingend notwendig. Aktuell ist jedoch noch kein vergleichbares Selektionsystem zur Ablösung des nptII/Kanamycin-Systems beim Apfel verfügbar. Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Funktionsfähigkeit und Anwendbarkeit des Flp/FRT-Rekombinationssystems zur nachträglichen Entfernung des nptII-Gens an Apfel untersucht. Ziel dabei war die Erzeugung gentechnisch modifizierter Apfelsprosse, die keinen Selektionsmarker mehr enthalten. Für die Untersuchungen wurde ein Monitoringvektor erstellt und in den Agrobakteriumstamm GV3101-pMP90RK übertragen. Mit diesem Stamm wurden in 17 Transformationsexperimenten insgesamt 4.080 in-vitro-Apfelblätter inokuliert und neun transgene Linien aufgebaut. Der transformierte Vektor enthält auf der funktionellen T-DNA einen CaMV 35S-Promotor und ein gusA-Reportergen. Dazwischen liegt ein sogenanntes FRT-flankiertes Fragment, welches das gusA-Gen räumlich vom CaMV 35S-Promotor trennt. Dieses FRT-flankierte Fragment besteht aus dem nptII-Markergen und dem flp-Rekombinase-Gen, welches von dem Hitzestress-induzierbaren Promotor Gmhsp17.5E aus der Sojabohne Glycine max reguliert wurde. Eine Expression von gusA wurde somit erst nach der Entfernung des FRT-flankierten Fragments erwartet. Dies ermöglichte eine schnelle Detektion von Rekombinationsereignissen mittels histologischen GUS-Tests. Die Linie T670 war die erste transgene Apfellinie, die selektiert und vermehrt werden konnte. Mit den Sprossspitzenkulturen dieser Linie wurden verschiedene Zeit- und Temperaturregime zur Induktion des Gmhsp17.5E-Promtors durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass eine Behandlung transgener Apfelsprosse bei 42°C Flp-vermittelte Rekombinationen bewirkte. Die Hitzestress-induzierte Rekombination erfolgte jedoch nicht in allen Zellen gleichzeitig, denn es wurden überwiegend Sprosse mit Mischgeweben detektiert. Um vollständig nptII-freie, transgene Apfelsprosse zu erzeugen, wurden die Blätter der Linien T670, T781, T782 und T793 nach einer Hitzestress-Behandlung geerntet und die Blattstreifen für 16 Wochen auf Regenerationsmedium ohne selektierendes Kanamycin aufgelegt. Für die Detektion putativ nptII-freier Sprosse wurden im Anschluss an die Regeneration stichprobenartig jeweils bis zu 40 Sprossregenerate ausgewählt und mittels GUS-Test analysiert. Auf diese Weise konnten bis zu 38 Prozent GUS-positive, putativ nptII-freie Sprossregenerate identifiziert werden. Die molekularen Untersuchungen an genomischer DNA und mRNA verschiedener Sprossregenerate der Linien T781 und T782 haben gezeigt, dass die Regeneration Hitzestress-behandelter Blätter vollständig nptII-freie Apfelsprosse erzeugte. Um das Flp/FRT-Rekombinationssystem praxisorientiert zu verbessern, wurde ein weiterer Monitoringvektor konstruiert, welcher ein zusätzliches Selektionssystem enthält. Mit diesem zweiten Selektionssystem könnten nptII-freie Sprossregenerate gezielt selektiert und der Vektor später zur Übertragung gewünschter Zielgene eingesetzt werden. Auf diese Weise ist es zukünftig möglich, gentechnologisch modifizierte Apfelpflanzen zu erzeugen, die langfristig keine Antibiotikaresistenzgene mehr tragen. Ein weiteres grundlegendes Ziel gentechnologischer Arbeiten in der Apfelzüchtung besteht in der Erhöhung der Resistenz gegenüber biotischen Schaderregern. Im Mittelpunkt des Interesses steht besonders die Verbesserung der Resistenz gegenüber phytopathogenen Pilzen, wie dem Apfelmehltau Podosphaera leucotricha und dem Apfelschorf Venturia inaequalis. Für verschiedene apfeleigene Resistenzquellen existieren zwar molekulare Marker, die Sequenzen beteiligter Resistenzgene sind bisher jedoch kaum identifiziert. Aus diesem Grund ist die Verwendung arteigener Resistenzgene für gentechnologische Ansätze bislang kaum möglich. Eine Erfolg versprechende Methode stellte deshalb die RNAi-basierte Stilllegung von Genen des Krankheitserregers dar. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Experimente mit Apfel durchgeführt, die eine wirtinduzierte Abwehrstrategie gegenüber den pilzlichen Schaderregern untersuchten. Als erstes wurde der Transport synthetischer, Fluoreszein-markierter siRNA-Moleküle aus pflanzlichen Blättern in die Hyphen von P. leucotricha gezeigt. Die Behandlung des Pilzes mit einem Atmungsblocker hat zusätzlich verdeutlicht, dass die Aufnahme pflanzlicher siRNAs in pilzliche Infektionsstrukturen wahrscheinlich ein ATP-abhängiger Prozess ist. Der effiziente Einsatz eines RNAi-induzierten Resistenzmechanismus an Apfelpflanzen setzt die Stilllegung eines essentiellen Pilzgens voraus. Hierfür wurde das Chitinsynthase Klasse V-Gen als potentielles Target ausgewählt und mit der Isolierung des Gens aus P. leucotricha und V. inaequalis begonnen. Die Expression dieses Gens ist für die Zellwandstabilität und die pilzliche Entwicklung essentiell (WERNER et al. 2007), weshalb die Stilllegung eines solchen Genes die Krankheitsentwicklung des Apfelmehltaus bzw. Apfelschorfs an transgenen Apfelblättern verlangsamen oder sogar hemmen könnte. ; One of the most important goals in genetic engineering is the generation of marker-free transgenic crops. Subsequent to an Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer, the nptII/kanamycin system is usually applied for the selection of transgenic apple cells (Malus x domestica BORKH.). In October 2002 the European government enacted a Council Directive (2001/18/EG) which prohibits the release of genetically modified (gm) organisms carrying selective markers such as the nptII gene. The establishment of alternative selection strategies is therefor compulsory. Still, until now no comparable system is available to replace the nptII/kanamycin selection system for apple transformation experiments. In the present study, the operability and applicability of the Flp/FRT recombination system in order to remove the nptII gene after the selection of transgenic apple cells was analyzed. The overall aim was the generation of gm apple plants which do not carry the selective marker. A monitoring vector was constructed and transfered into the Agrobacterium strain GV3101pMP90RK. The transgenic strain was then used to inoculate 4,080 in-vitro apple leaves in 17 different apple transformation experiments and nine gm apple lines were finally selected. The functional T-DNA of the vector contains the CaMV 35S promoter and a gusA reporter gene which were spatial separated by a FRT-flanked box. This FRT-flanked box contained the nptII gene and the flp recombinase gene which was regulated by the heat-shock-inducible promoter Gmhsp17.5E from the soybean Glycine max. Consequently, expression of gusA was only expected after elimination of the FRT-flanked box. Each recombination event could be detected by using histochemical GUS Assays. The first obtained transgenic apple line, T670, was used to investigate different time and temperature regimes for the Gmhsp17.5E promoter induction. An effective promoter induction and Flp-mediated recombination was observed after treatment of apple shoots at 42°C. However, the heat-shock-induced recombination did not occur concurrently in all cells, because shoots with chimeric tissues were often detected. To generate fully nptII-free gm apple plants, the leaves of the lines T670, T781, T782 and T793 were sampled after heat-shock-treatment and the explants placed on regeneration medium without the selective agent kanamycin for 16 weeks. Up to forty shoot regenerates were randomly chosen and analyzed using the GUS Assay after regeneration process in order to detect putative nptII-free apple shoots up. Using this method, up to 38 percent of the studied regenerates were identified as GUS positive and putatively nptII-free. In addition, the molecular analysis on genomic DNA and mRNA of selected shoot regenerates of the lines T781 and T782 showed that the regeneration of heat-shock-treated leaves generate fully nptII-free gm apple shoots. To increase the efficiency of Flp/FRT recombination system another monitoring vector was created which contained a second selection system. Using this second selection system, nptII-free apple plants could potentially be identified without the use of gusA. For the long therm the transfer of target genes and the generation of gm apple plants which do not carry antibiotic resistance genes will be possible. Another important aim in genetic engineering of apple breeding programs is the increase of resistance against biotic pathogens. Especially an improved resistance against pathogenic fungi like the apple powdery mildew Podosphaera leucotricha and apple scab Venturia inaequalis is highly requested. Althougt molecular markers exist for different apple resistant loci, nucleotide sequences of involved genes are yet unknown. Hence the use of apple resistance genes is not possible in genetic modification experiments of apple plants. A promising method is the RNAi-mediated gene silencing in pathogenic fungi. In the second part of the present study, experiments were thus conducted, performed in which a hostinduced defense mechanism against fungal pathogens was analyzed. First, we showed the transport of synthetic, Fluorescein-labeled siRNA molecules from plant leaves into the hyphae of P. leucotricha. The treatment of the fungus with a respiration blocker additionally illustrated that absorption of herbal siRNAs into fungal infection structures is probably an ATP-depended process. For an efficient application of RNAi-induced resistance mechanisms in gm apple plants, the silencing of an essential fungal gene is required. We chose the chitinsynthase class V gene as a potential target and started with the gene isolation from P. leucotricha and V. inaequalis. The expression of ChsV genes is essential for cell wall stability and fungal development (AMNUAYKANJANASIN et al. 2003; MADRID et al. 2003, WERNER et al. 2007). Due to these facts the silencing of ChsV may trigger a reduced or inhibited disease development of the apple powdery mildew disease or apple scab.

Multi-step biochemical pathways in plants is a challenging area of trait dissection as plants rapidly evolve novel specialized metabolites, often resulting in genus- or species-specific chemical compounds that are synthesized by unrelated gene families. Although the evolution of multi-step biochemical pathways catalyzed by proteins encoded by paralogous (duplicate) gene copies is understood to some extent, assembly of novel pathway steps across gene families is rarely investigated. Diterpenoids comprise one such area of divergent chemical traits in plants that are often restricted to limited taxa. As diterpenoid biosynthesis is catalyzed by families of diterpene synthases and cytochrome P450s, natural experiments in biochemical pathway assembly have occurred repeatedly during evolution. The conifer Norway spruce (Picea abies) is an industrially and ecologically important tree in northern, central, and eastern Europe that produces a rich mixture of defensive diterpenoids in high abundance. Conifers, particularly the family Pinaceae, uniquely produce a mixture of C20 diterpene resin acids that can flush out and/or suffocate invading pests. As Norway spruce dominate large forests in Europe, and is used as an ornamental tree and for lumber, beetle invasions that decimate populations of Norway spruce are devastating. Due to the availability of molecular tools for genetic dissection and a published genome, this thesis attempts to answer questions about the evolution of novel diterpenoid pathways in Norway spruce using a combination of bioinformatics and biochemical analyses. Additionally, this work investigates regulation of terpene pathways and attempts to identify pathway steps that control pathway flux using transgenic manipulation of diterpene synthases and cytochrome P450s.